Calprotection Lactoferrin

Keul-o-test^®

Calprotectin-Lactoferrin

KGST302

Ein schneller Ein-Schritt-Test für den qualitativen Nachweis von Calprotectin und Lactoferrin in humanen Fäces. Nur für den professionellen Gebrauch in der In vitro-Diagnostik. Sensitiver Marker für entzündliche Darmerkrankungen und zur Früherkennung von kolorektalen Karzinomen.

Verwendungszweck
Der Calprotectin-Lactoferrin-Test ist ein immunchromatographischer Schnelltest (ein nicht-invasiver Assay) für den qualitativen Nachweis von Calprotectin und Lactoferrin in humanen Fäces-Proben zur Verwendung in der Diagnose von entzündlichen gastrointestinalen Erkrankungen.

Zusammenfassung
Bei Calprotectin handelt es sich um ein calciumbindendes Protein. Es stellt 5% des Gesamtproteins und 60% der cytosolischen Proteine von Neutrophilen dar. Calprotectin verfügt über bakteriostatische und fungistatische Eigenschaften und liegt in Fäces in sechsfach höherer Konzentration als in Plasma vor. Calprotectin ist ein nützlicher fäkaler Biomarker für die Bestimmung der Aktivität inflammatorischer Darmerkrankungen (Inflammatory Bowel Disease (IBD)). Die unter dem Begriff IBD zusammengefassten Erkrankungen schließen Morbus Chron (Crohn’s Disease (CD)) und Colitis ulcerosa (Ulcerative Colitis (UC)) ein und sind mit einer Erhöhung der Neutrophilen verbunden.
Der vorliegende fäkale Calprotectin-Assay dient zur Unterscheidung organischer gastrointestinaler Erkrankungen (IBD) von funktionalen gastrointestinalen Störungen (Intestinal Bowel Syndrome (IBS)). Es handelt sich um einen einfachen, nicht-invasiven Biomarker-Test. Dieser Test ist bei der Untersuchung von Kindern von besonderem Nutzen, da bei Kindern zur Durchführung einer Darmspiegelung eventuell eine Vollnarkose erforderlich ist. Der Nachweis von fäkalem Calprotectin kann zur Vorhersage eines Rezidivs dienen.
Bei Lactoferrin (Lf) handelt es sich um ein Glycoprotein. Es wird von Neutrophilen, mononukleären Phagocyten und Epithelzellen produziert und ist in Sekreten wie beispielsweise Speichel und Muttermilch enthalten. Lactoferrin blockiert das bakterielle Wachstum, indem es die Verfügbarkeit von Eisen limitiert. Dieser Effekt wird durch das Vorliegen spezifischer, gegen Bakterien gerichtete sekretorischer IgA-Antikörper verstärkt. Indem das Protein zusammen mit Lysozym Zellmembranen direkt schädigt, hat Lf darüber hinaus eine bakterizide Wirkung. Entwickelt sich im Gastrointestinaltrakt eine Entzündung, dann migrieren Neutrophile und Phagocyten an den Ort des Entzündungsherds und setzen Lf-haltige Granula frei. Lf ist in Fäces stabil und kann unter Anwendung immunchemischer Methoden einfach nachgewiesen werden.
Das Markerprotein Lf ist in Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen erhöht. Entzündliche Darmerkrankungen (IBD), einschließlich Colitis ulcerosa (UC) und Morbus Crohn (CD), stellen ein Krankheitsspektrum dar, das sich durch eine den Gastrointestinaltrakt (GI-Trakt) betreffende idiopathische und chronische Entzündung auszeichnet. Pädiatrische und adulte Patienten mit IBD können verschiedene, möglicherweise unspezifische klinische Symptome aufweisen (einschließlich Unterleibsschmerzen und Durchfall).
Laktoferrin ist als Degranulationsprodukt in polymorphkernigen Granulozyten enthalten. Bei Entzündungen im Gastrointestinaltrakt wandern Granulozyten in die Darmwand und Laktoferrin wird ins Darmlumen freigesetzt.
Die Bestimmung des Laktoferrins im Stuhl wird insbesondere bei Kindern zur Diagnostik und Therapiekontrolle entzündlicher Darmerkrankungen eingesetzt. Sowohl bei bakteriellen als auch bei viralen Infektionen sowie bei Morbus Crohn und Colitis ulcerosa steigt der Wert im Stuhl an infolge des Einwanderns von Granulozyten in die Darmwand.
Bei Erwachsenen wird als Parameter für Entzündungen in der Regel Calprotectin vorgezogen, der eine höhere Sensitivität und Spezifität aufweist.
Lactoferrin ist ein guter Marker für die intestinale Entzündungsaktivität. Unter erfolgreicher Therapie fällt das Lactoferrin auf Normalwerte zurück, so dass der Test sehr gut zur Begleitung der Therapie und frühzeitiger Erkennung eines erneuten Schubs einer entzündlichen Darmerkrankung geeignet ist.
Der Test wird auch eingesetzt zur Abgrenzung nicht entzündlicher Erkrankungen, wie z. B. das Reizdarmsyndrom.

Verlaufskontrolle bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen(M. Crohn,  Colitis ulcerosa unbekannter Aktivität), Frühdiagnose entzündlicher Schübe
Calprotectin ermöglicht die Vorhersage eines Relaps mit einer Sensitivität von 90 Prozent und einer Spezifität von 83 Prozent, da es auch bei ruhender (inaktiver) Erkrankung im Vergleich zu gesunden Kontrollen leicht erhöht ist. Die Krankheitsaktivität korreliert dabei mit dem Calprotectin-Wert. Die endoskopische bzw. histologische Einstufung korreliert ebenfalls mit dem Calprotectin-Wert. Daraus kann geschlossen werden, dass fäkales Calprotectin die Entzündung auf Gewebsebene widerspiegelt. Dies trifft auch zu, wenn eine Therapie mit nichtsteroidalen Antiphlogistica stattgefunden hat.

Chronische Diarrhoe unbekannter Ursache -Unterscheidung Colon irritabile / M. Crohn
Ebenso hoch ist der diagnostische Wert des Calprotectins bei der Unterscheidung zwischen dem Colon irritabile und M. Crohn mit einerSensitivität von 100 Prozentund einer Spezifität von 97 Prozent. Calprotectin ist damit der sensitivste Stuhlmarker, der mit M. Crohn in Verbindung gebracht wird.

Früherkennung von kolorektalen Karzinomen
Der fäkale Calprotectin-Spiegel ist ein aussagekräftiger Marker für die Früherkennung von kolorektalen Karzinomen.Vergleichende Messungen von Calprotectin und Okkultbluttesten zeigen eine hohe Sensitivität des Calprotectins beim Nachweis von kolorektalen Karzinomen (auch nicht-blutenden!) bei einer Spezifität von bis zu 97Prozent, wenn bei der Tumorerkrankung eine entzündliche Komponente besteht.Beim Nachweis von Polypen (auch nicht-blutenden) wird eine Sensitivität von ca. 88Prozenterreicht, sofern auch hier ein entzündliche Aktivität der Darmwand besteht!

 Auch bei Enteritis infektiöser Ursache ist Calprotectin auf Grund der Leukozyten–Migration in das Darmvolumen erhöht.

Prinzip
Bei dem vorliegenden Calprotectin-Lactoferrin-Test handelt es sich um einen qualitativen Immunassay für den Nachweis von Calprotectin und Lactoferrin in Fäcesproben. Die Membran der Testvorrichtung ist im Bereich der Testbanden mit monoklonalen Antikörpern gegen Calprotectin und Lactorferrin vorbeschichtet. Während der Testdurchführung reagiert die Probe mit den Partikeln, die mit Antikörpern gegen humanes Calprotectin und humanes Lactoferrin beschichtet sind und auf dem Teststreifen aufgetrocknet sind. Die Mischung wandert durch Kapillarwirkung entlang der Membran. Bei einem positiven Ergebnis reagieren die Antikörper auf der Membran mit dem Konjugat der Mischung und bilden eine Farbbande. Im Bereich der Kontrollbande erscheint, unabhängig vom Testergebnis, eine grüne Farbbande. Diese Bande dient als interne Kontrolle für die Reagenzien sowie als ein Nachweis dafür, dass ein ausreichendes Volumen pipettiert wurde und die Mischung korrekt gewandert ist.
Unter den vielen Leukozyten-Markern, die bei entzündlichen Darmerkrankungen im Stuhl nachweisbar  sind, nimmt das Calprotectin eine besondereStellung ein.Calprotectin ist ein calciumbindender Proteinkomplex mit antibakteriellen Eigenschaften, der von neutrophilen Granulocyten und Monocyten gebildet wird. Calprotectin stellt etwa 60 Prozent der löslichen cytosolischen Proteine der Neutrophilen dar.
Fäkales Calprotectin ist ein sensibler Marker für entzündliche und neoplastische Darmerkrankungen.  Da es in den Fäzes sehr stabil ist (bis zu eine Woche bei Raumtemperatur), eignet es sich besonders als Frühindikator für die mucosale Entzündung. Spot samples sind ebenso zuverlässig wie die Messung aus gesammeltem 24-h-Stuhl, was den Marker sicher und für den Patienten akzeptabel macht. Postversand der Proben zum Labor ist problemlos möglich.

Vorsichtsmaßnahmen

• Nur für den professionellen Gebrauch in der In vitro-Diagnostik.
• Verwenden Sie das Produkt nach Ablauf des Verfallsdatums nicht mehr.
• Der Test sollte erst unmittelbar vor der Verwendung aus der Folientasche entnommen werden.
• Verwenden Sie den Test nicht, wenn die Folientasche beschädigt ist.
• Befolgen Sie die Grundsätze Guter Laborpraxis. Tragen Sie Schutzkleidung und verwenden Sie Einweghandschuhe. Essen, trinken oder rauchen Sie nicht am Arbeitsplatz.
• Alle Proben sollten als mögliche Risikostoffe eingestuft und entsprechend infektiösem Material (Krankheitserregern) behandelt werden.
• Nach der Testdurchführung sollte die Testvorrichtung in einem geeigneten Behälter für biologische Risikostoffe entsorgt werden.
• Die Testdurchführung muss innerhalb von 2 Stunden nach dem Öffnen der versiegelten Folientasche erfolgen.

Lagerung und Stabilität
Lagern Sie das Produkt in der ungeöffneten, versiegelten Folientasche entweder im Kühlschrank oder bei Raumtemperatur (2-30ºC/36-86ºF). Der vorliegende Test ist bis zum Erreichen des auf der versiegelten Folientasche aufgedruckten Verfallsdatums stabil. Der Test darf erst unmittelbar vor Gebrauch aus der versiegelten Folientasche entnommen werden. Frieren Sie das vorliegende Produkt nicht ein.

Enthaltenes Material

• Calprotectin-Lactoferrin Testvorrichtung
• Gebrauchsanleitung
• Probenahmefläschchen mit Puffer

Benötigtes, nicht enthaltenes Material

• Probenahmebehälter
• Einweghandschuhe
• Zurzzeitmesser

Probenahme und Vorbereitung
Nehmen Sie eine ausreichende Menge Fäces-Probe (1-2 g oder ml bei flüssigen Proben). Die Probenahme von Stuhlproben sollte dabei unter Verwendung sauberer und trockener Behälter erfolgen. (Verwenden Sie keine Konservierungsmittel oder Transportmedien.). Bis zur Testdurchführung kann die Lagerung der Proben für eine Dauer von 7 Tagen im Kühlschrank (2-4ºC/36-40ºF) erfolgen. Für eine längere Lagerdauer müssen die Proben bei-20ºC/-4ºF eingefroren gelagert werden. Gefrorene Proben müssen vor der Testdurchführung vollständig aufgetaut und auf Raumtemperatur erwärmt werden.

Verfahren
Bearbeitung der Stuhlproben (siehe Abbildung 1):
Verwenden Sie für jede Probe ein eigenes Probenahmefläschchen. Schrauben Sie den Deckel des Fläschchens ab und stecken Sie den Probenahmestab vier Mal in unterschiedliche Stellen der Fäces-Probe, um die Probe aufzunehmen. Schrauben Sie den Deckel wieder auf das Fläschchen mit dem Puffer und der Stuhlprobe. Schütteln Sie das Fläschchen, um eine gute Durchmischung der Probe zu gewährleisten. Nehmen Sie bei der Verwendung flüssiger Stuhlproben die Probe mit Hilfe einer Pipette auf. Pipettieren Sie 15 µl in das Probenahmefläschchen mit dem Puffer.
Testverfahren (siehe Abbildung 2)
Warten Sie mit der Testdurchführung, bis die Testvorrichtungen, die Stuhlproben und die Puffer Raumtemperatur erreicht haben (15-30ºC/59-86ºF). Öffnen Sie die Folientaschen erst unmittelbar vor der Testdurchführung.

1. Entnehmen Sie die  Calprotectin-Lactoferrin-Testvorrichtung aus der versiegelten Folientasche und verwenden Sie die Testvorrichtung so bald wie möglich. Legen Sie die Testvorrichtung auf eine saubere und ebene Arbeitsfläche.
2. Schütteln Sie das Probenahmefläschchen, um eine gute Durchmischung der Probe zu gewährleisten. Brechen Sie die Spitze des Fläschchens ab.
3. Verwenden Sie für jede Probe eine eigene Testvorrichtung. Geben Sie 4 Tropfen oder 100 µl in den Probennapf (S). Starten Sie den Kurzzeitmesser.
4. Lesen Sie das Ergebnis 10 Minuten nach Zugabe der Probe ab.

Abbildung 1

Abbildung 2

Ergebnisauswertung

Abbildung 3

POSITIV:

Calprotectin positiv: Zwei Linien erscheinen im zentralen Fenster, eine rote Testlinie mit den Buchstaben T1 gekennzeichnet und im Kontrollbereich eine grüne Kontrolllinie mit dem Buchstaben C.

Lactoferrin positiv: Zwei Linien erscheinen im zentralen Fenster, eine rote Testlinie mit den Buchstaben T2 gekennzeichnet und im Kontrollbereich eine grüne Kontrolllinie mit dem Buchstaben C.

Calprotectin-Lactoferrin positiv: Drei Linien erscheinen im zentralen Fenster, die zwei roten Testlinien (T1 und T2) und im Kontrollbereich eine grüne Kontrolllinie mit dem Buchstaben C.

NEGATIV: Nur eine grüne Linie erscheint in dem mit dem Buchstaben C gekennzeichneten Kontrolllinienbereich (Kontrolllinie).

UNGÜLTIG: Ein vollständiges Fehlen der grün gefärbten  Kontrolllinie, unabhängig vom Auftreten oder Fehlen der Testlinien. Hinweis: Die Hauptursache für das Fehlen der Kontrollbande ist ein unzureichendes Probenvolumen, eine inkorrekte Testdurchführung oder die Verwendung unbrauchbarer, verdorbener Reagenzien. Überprüfen Sie das Testverfahren und wiederholen Sie den Test unter Verwendung einer neuen Testvorrichtung. Tritt das Problem weiterhin auf, dann verwenden Sie das Test-Kit nicht mehr und kontaktieren Sie Ihren lokalen Vertriebshändler. Siehe Abbildung 3.

Hinweise zur Ergebnisauswertung
Die Intensität der rot gefärbten Testlinien in den Ergebnisbereichen (T1 und T2) variiert in Abhängigkeit von den Calprotectin- und / oder  Lactoferrin-Konzentrationen der Probe. Trotzdem kann mit diesem qualitativen Test weder ein quantitativer Wert, noch ein Anstieg des Calprotectins und / oder Lactoferrins bestimmt werden.

Qualitätskontrolle
Der vorliegende Assay beinhaltet interne Verfahrenskontrollen:

• Im Bereich der Kontrollbande (C) erscheint eine grüne Bande. Sie zeigt an, dass ein ausreichendes Probenvolumen verwendet und der Test korrekt durchgeführt worden ist.
• Ein klarer Hintergrund dient als interne Negativkontrolle. Funktioniert der Test ordnungsgemäß, dann sollte der Hintergrund im Ergebnisbereich klar erscheinen und ein leichtes Ablesen der Testergebnisse ermöglichen.

Einschränkungen

1. Der Calprotection-Lactoferrin-Test zeigt nur das Vorhandensein von humanen Calprotection und / oder Lactoferrin in Proben an (qualitativer  Nachweis) und sollte nur zum Nachweis von Calprotection und Lactoferrin in Stuhlproben verwendet werden. Weder ein quantitativer Wert noch ein Anstieg von Calprotection oder Lactoferrin können mit diesem Test bestimmt werden.
2. Ein Probenüberschuss kann falsche Ergebnisse zur Folge haben. (Es treten braune Banden auf.) Verdünnen Sie die Probe unter Verwendung des Puffers und wiederholen Sie den Test.
3. Einige Stuhlproben können die Intensität der Kontrollbande abschwächen.
4. Positive Calprotectin-Ergebnisse bestätigen das Vorliegen von Calprotectin in Fäkalproben. Diese Ergebnisse können jedoch auf unterschiedliche Ursachen zurückzuführen sein (inflammatorische Darmerkrankunen, Darmkrebs und verschiedene Enteropathien). Positive Ergebnisse sollten vom Arzt mit Hilfe zusätzlicher Diagnoseverfahren weiter untersucht werden, um den genauen Grund der Entzündung zu bestimmen.
5. Gesunde Neugeborene weisen erhöhte Calprotectin-Werte auf. Mit einem Median von 167 µg/g können neonatale fäkale Calprotectin-Konzentrationen auftreten, die höher sind als die Werte, die bei gesunden (älteren) Kindern bestimmt werden.
6. Positive Lactoferrin-Ergebnisse bestätigen das Vorliegen von humanem Lactoferrin in Fäkalproben. Das Vorliegen von humanem Lactoferrin in Fäkalproben kann jedoch auch andere Ursachen haben und muss nicht auf IBD zurückzuführen sein. Ein positives Ergebnis sollte mit Hilfe zusätzlicher Diagnoseverfahren weiter untersucht werden. Endoskopische Untersuchungen und die histologische Analyse von Biopsieproben dienen als Methoden für den Nachweis und die Quantifizierung von Darmentzündungen.
7. Lactoferrin ist ein Bestandteil der Muttermilch. Der vorliegende Test erbringt in Kindern, die gestillt werden, ein positives Ergebnis. Der vorliegende Test sollte daher nicht für die Untersuchung Neugeborener verwendet werden, die Muttermilch erhalten

Erwartungswerte
Höhere Calprotectin-Konzentrationen im Stuhl sind mit einem erhöhten Rückfallrisiko bei Patienten mit inflammatorischen Darmerkrankungen (IBD) assoziiert. In verschiedenen Studien wurde eine Konzentration von mindestens 50µg hFCP/g Fäces als Grenzwert etabliert, um adulte Patienten mit entzündlichen Störungen des Gastrointestinaltrakts zu identifizieren. Eine Probe mit einer Lactoferrin-Konzentration von mindestens 10ug hLf/g Fäces führt bei Verwendung der Calprotectin-Lactoferrin-Testvorrichtung zu positiven Ergebnissen.

Leistungsmerkmale
Cut-Off-Wert
Der Cut-Off-Wert des Calprotectin-Lactoferrin-Tests ist 500 ng/mL (50µg hCp/g Stuhl) für humanes Calprotection und 100 ng/ml (10 µg hLf/g Stuhl) für humanes Lactoferrin.
Sensitivität und Spezifität
Mit dem Calprotection-Lactoferrin-Test wurde eine Evaluation mit Patientenproben durchgeführt. Der  Calprotectin-Lactoferrin-Tests wurde evaluiert im Vergleich mit anderen kommerziellen Immunoassays (Calprest ® Eurospital und IBD EZ VUE® TechLab®).
Sensitivität: >94% und Spezifität 93% verglichen mit Calprest ® Eurospital (Calprotection Testlinie)
Sensitivität: >99% und Spezifität >99% verglichen mit IBD EZ VUE® TechLab® (Lactoferrin Testlinie).
Kreuzreaktivität und Interferrenzen
Eine Evaluation wurde durchgeführt, um die Kreuzreaktivität und die Interferrenzen des Calprotection-Lactoferrin-Tests zu bestimmen. Es besteht keine Kreuzreaktivität gegenüber anderen fäkalen Markern, die gelegentlich im Stuhl vorkommen

• Rinder- und Schweinehämoglobin
• Rinderlactoferrin
• Rinder- und Schweinetransferrin
• humanes Hämoglobin
• humanes Transferrin

Abrechnung
Die  Abrechnung Calprotectin ist eine kurative Leistung (GKV und PKV).

 * zzgl. einmalige Auslagen nach § 10 der GOÄ

Literatur

• VIEIRA, A. et al., „Inflammatory bowel disease activity assessed by fecal calprotectin and lactoferrin: correlation with laboratory parameters, clinical, endoscopic and histological indexes“, BMC Research Notes 2009, 2:221.
• HANAI, H. et al. «“Relationship Between Fecal Calprotectin, Intestinal Inflammation, and Peripheral Blood Neutrophils in Patients with Active Ulcerative Colitis“ Digestive Diseases and Sciences, Sept. 2004, Vol 49, No 9, pp 1438-1443.
• BONNIN TOMAS, A, et al. „Calprotectina fecal como marcador diferencia entre patología gastrointestinal orgánica y funcional“. Rev. Esp. de Enf. Dig. 2007, Vol 99, No 12, pp. 689-693.
• Amemoto K. et al. Clinical evaluation of fecal lactoferrin and -1-antitrypsin in pediatric gastrointestinal infections, Pathophysiology. Vol 3; 1996, p. 87-90.
• Walker, T.R. et al. Fecal Lactoferrin is a Sensitive and Specific Marker of Disease Activity in Children and Young Adults with Inflammatory Bowel Disease. J. Pediatr Gastroenterol. Nutr. April 2007; Vol 44, No 4, p. 414-422.
• Sugi K, Saitoh OI, Katsu K. Fecal lactoferrin as a marker for disease activity in inflammatory bowel disease: Comparison with other neutrophil-derived proteins. Am. J. Gastoenterol 1999, 91:927-934.
  Thomas L. Labor und Diagnose. 8. Auflage 2012, 774 ff

Qualitätssicherung und Vorkommnisse
Sollten Sie den Eindruck eines Qualitätsmangels haben oder unklare oder ihrerseits falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse erhalten, bitten wir Sie, die betreffende Patientenprobe zurückzustellen und für einen Abruf für uns bereitzuhalten.
Bitte informieren Sie uns umgehend. Sie helfen uns dadurch die Sicherheit der Produkte und damit die Qualität zu gewährleisten.

Hersteller:

Günter Keul GmbH Von-Langen-Weg 10 D-48565 Steinfurt Tel.: 02551/2097  Fax.: 02551/80883 Web: www.keul.de

(akt. 08.01.2016)